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柠檬苦素脂质体的制备和制剂学评价

2020-08-27

  柠檬苦素(limonin,LM)又名黄柏内酯,是一种三萜类化合物,常见于芸香科和楝科植物中。近年来研究发现,LM具有多重生物活性,包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗焦虑及防虫杀虫等作用。其中对其抗肿瘤的报道较多,如LM可阻断己糖激酶-2磷酸化,诱导HCC肝癌细胞凋亡和抑制糖酵解,甚至可以通过激活PI3K/Akt信号通路降低癌细胞干性。然而LM存在溶解度低、稳定性差、生物利用度低、代谢快等缺点,大大限制了其应用。

柠檬苦素脂质体的制备和制剂学评价

  脂质体(liposome,Lip)是一种具有类生物膜结构的纳米囊泡,具有良好的生物相容性和稳定性。由于其结构中存在亲水的空腔和疏水的双层磷脂膜,因此对亲水和疏水性药物均有较好的包载能力,在改善药物溶解性、渗透性,提高生物利用度等方面均有广泛的应用开发价值[7-11]。通过脂质体包裹LM有望提高药物的溶解度和相关制剂学性能。


  本实验采用薄膜分散法[12-13]制备柠檬苦素脂质体(LM@Lip),并以包封率和粒径为指标,通过单因素实验和正交试验进行处方筛选及制备工艺优化,并对载药脂质体进行制剂学和体外抗肿瘤评价,为LM的开发应用提供科学依据。


  2.1 LM@Lip的制备

  采用薄膜分散法制备载药脂质体LM@ Lip。具体操作:向茄状瓶(容量250 mL)中置入适量SPC、CH、LM,分别加入20 mL溶剂,充分溶解后,置于旋蒸仪中,调节至适合的水浴温度,旋蒸5 h,使茄状瓶底部的溶剂被彻底除去,并使其底部铺盖一层均匀的脂质薄膜。加入9mL超纯水震荡,使之充分水化至溶液均一,将制剂转移至西林瓶中,并置于冰水中使用超声波细胞膜破碎机超声,最后使用孔径为0.45 μm一次性水性滤膜滤过,即得LM@Lip。


  2.2 LM含量测定

  2.2.1 色谱条件[16] 汉邦科技Hedera ODS-2色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-水(70∶30),体积流量1.0 mL/min,进样量10 μL,检测波长210 nm,柱温30 ℃。


  2.2.2 对照品溶液制备 精密称取LM 12.5 mg,加入适量的无水甲醇,超声1 min,以使其充分溶解,并用无水甲醇在量瓶中定容至25 mL,涡旋1 min,混匀,得到0.5 mg/mL的LM对照品储备液。


  2.2.3 供试品溶液制备 取制备LM@Lip 0.1 mL,用甲醇稀释100倍,12 000 r/min离心,取上清液,即得。


  2.2.4 专属性实验 取用甲醇破乳后的空白脂质体溶液,以及稀释得到的10 μg/mL的LM对照品溶液分别进样,记录色谱图。LM大约在3.86 min出峰,而空白脂质体在这一时刻不出峰,表明载体并不会对待测组分产生干扰。


  2.2.5 线性关系考察 向10 mL量瓶中精确移取LM储备液0.01、0.02、0.1、0.2、0.5、1 mL,加入无水甲醇,使液面相切于刻度标识,混匀,得0.5、1、5、10、25、50 μg/mL的系列对照品溶液,依次进样,求算标准方程,经计算得定量标准方程为Y=5 890.06 X-729.15,线性相关系数为0.9994,结果表明LM标准曲线的峰面积与质量浓度在0.5~50 μg/mL呈良好的线性相关性。


  2.2.6 精密度试验 分别取“2.2.2”项下所制备的0.5、10.0、50.0 μg/mL LM对照品溶液。每份平行测定6次,测得的精密度RSD分别为4.38%、2.27%、0.19%,表明仪器精密度良好。


  2.2.7 加样回收率试验 精确量取适量LM储备液,用无水甲醇分别稀释成0.5、10、50 μg/mL。同时取适量空白脂质体3份,分别加入以上对照品溶液中混合,按2.2.3项下操作进样。测得的LM回收率分别为106.88%、105.35%、101.15%,RSD分别为2.32%、3.46%、3.73%,符合检测要求。


  2.3 脂质体粒径、PDI及Zeta电位测定

  取制备的LM@Lip适量,加入适宜量超纯水调整粒子浓度后,置入样品池中。使用Malvern粒度分析装置检测粒径、PDI及Zeta电位,测得制剂的平均粒径为(119.5±6.2)nm,PDI为0.318±0.124(图2),Zeta电位为(−17.2±1.3)mV,所制得LM@ Lip粒径合乎要求。


  2.4 脂质体包封率及载药量的测定

  包封率指包载于脂质体内的药物量占总药量的百分比。载药量意为某一质量脂质体中负荷的药量,与制剂的药物浓度密切关联。上述指标被广泛用于脂质体的质量考察、工艺优化及处方筛查[17-18]。本课题预实验证明LM的平衡溶解度小于1 μg/mL,故使用过膜法评判脂质体的包封率和载药量。取制备好的LM@Lip 2mL,过0.45 μm滤膜,再取过膜前后LM@Lip各200 μL分别置于2.5 mL EP管中,各加入适量甲醇,涡旋2 min,使之充分破膜,通过HPLC分别测定过膜前后脂质体中的LM含量。包封率和载药量的计算方法如下公式。按上述方法求得LM@Lip中LM的包封率为87.9%,载药量为0.57%,药物质量浓度为63.4 μg/mL(n=3)。


  包封率=We/(We+W0)

  载药量=We/(We+W)

  We为包载于脂质体中的药量,W0为未包载于脂质体中的药物量,W为脂质体中脂质的质量。


  2.5 LM@Lip处方优化

  据参考文献,一般以包封率及粒径为指标,通过单因素实验分别考察溶剂(二氯甲烷、无水甲醇、三氯甲烷)、药脂比(0.5∶100、0.75∶100、1∶100、2∶100)、胆脂比(1∶3、1∶6、1∶9、1∶12)、旋蒸时间、温度及探头超声条件对LM@Lip制备的影响。根据单因素实验的考察,发现探头超声条件(A)、药脂比(B)及胆脂比(C)对脂质体质量的影响最大,为了科学地考察上述因素对脂质体质量的影响,选择以上3者分别作为正交试验的3种实验因素,并从每种因素中选出最优的3种条件分别作为正交试验的3种水平[20],见表1。根据以上3因素3水平,以包封率为判定依据,按照正交试验表L9(33)进行实验。


  3种实验因素对脂质体包封率的影响由大至小分别为超声条件(因素A)、药脂比(因素B)、胆脂比(因素C)。根据正交试验,最令人满意的因素与水平为A1B3C2,即超声功率20%,持续时间6 min,药脂比1∶200,胆脂比1∶9,这与单因素实验中初步筛选出的条件一致,表明正交试验结果的可信度较高。与此同时,单因素实验表明,药脂比为1∶200和1∶150时,包封率分别为85.7%和84.0%,但药脂比为1∶150时,由于载药量的提升,药物浓度明显高于药脂比为1∶200时;同时,正交试验也表明,在一定范围内适当改变药脂比并不会对包封率产生显著影响(P=0.1),故最终确定该制剂的制备条件为A1B2C2,即超声功率20%,超声时间6 min,药脂比1∶150,胆脂比1∶9。


  2.6 体外释放实验

  向截留相对分子质量3 400的透析袋中精确移取LM@Lip2 mL,用封口夹将透析袋两端夹紧,放置于50 mL磷酸盐缓冲液(PBS)中,模拟pH 7.4的血液环境。向其中加入1%聚山梨酯-80,使用空气摇床振荡,保持摇床温度为37 ℃,分别于0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h取样2 mL,并补足新鲜介质,样品离心后,按色谱分析方法测定LM释放量,以累积释放量对时间绘制释药曲线。,药物在1.0 h时释放23.78%,2.0 h后基本释放平稳,呈现出缓释现象,12.0 h测得的累积释放量为58.59%,表明药物的体外释放呈现先快后慢的规律,能够维持较长的药物释放周期。


  2.7 细胞毒性实验

  为了考察LM@Lip对肿瘤细胞的抑制作用,本实验选择了2种不同来源的肿瘤细胞:人肝癌HepG2细胞和人肺腺癌A549细胞。取对数生长期的HepG2细胞或A549细胞,以1×104/孔密度接种于96孔板,在细胞培养箱中培养12h,移去细胞培养基,加入不同质量浓度的LM及LM@Lip的不完全培养基200 μL(LM的质量浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、30.0、60.0 μg/mL),细胞随后置于培养箱中孵育24 h,吸去含药培养基,加入200 μL PBS清洗1次,加入200 μL含有MTT的不完全培养基,37 ℃孵育4 h,吸弃培养基,加150 μL DMSO,置于摇床摇匀,酶标仪570 nm处测定吸光度(A)值,LM@Lip对HepG2细胞和A549细胞的IC50分别为20.16、15.39 μg/mL,LM对2种细胞的IC50分别为46.84、39.53 μg/mL,可见LM经脂质体包覆后,能有效提高其抗肿瘤活性,这可能与脂质体改变了药物的油水分配性质和摄取行为有关。


  本实验通过单因素考察和正交设计优化脂质体处方。过程中发现,超声条件对脂质体质量影响较大,其可能的原因是,超声时间不足,功率较低时,脂质体匀化效果较差,不同大小粒径的脂质体均存在,这可能是导致PDI较大的原因之一;而超声时间过长,空化效应可能导致脂质体破坏,造成药物的泄露和包封率降低。因此,调节合适的超声分散条件对脂质体质量有重要影响。此外,目前比较常用的高压均质、微射流等技术在脂质体分散方面亦有较好的应用,且更适宜较大量脂质体的生产。


  在制备脂质体的过程中,发现随着药脂比的增加,包封率在一定的范围内呈现下降趋势,药脂比过低则会降低载药量,故本实验中通过正交试验设计筛选药脂比最优比值以得到较高的包封率和载药量。胆固醇对脂质体的物理化学性质也有着较大的影响,研究表明在胆固醇用量在40%以下时,随着胆固醇浓度的增加,脂质体膜双分子层的微黏度逐渐增加,流动性逐渐减小,脂质体的包封率会有所下降,粒径会趋向变大并对脂质体稳定性有一定的影响。故本实验在胆固醇含量较小的范围内进行筛选,发现较小的胆脂比对脂质体包封率无显著影响,故结果选择较小的胆脂比(1∶9)进行后续实验,以保证脂质体具有合适的粒径和较高的包封率。


  脂质体的制备方法很多,常用的方法有薄膜分散法、高压均质法、逆相蒸发法和表面活性剂增溶法等。本实验采用薄膜分散法,操作方便,易于工业化生产。


  本实验选用的脂质材料为大豆磷脂和胆固醇,均为安全常用的脂质体材料,价廉易得,便于后续产品放大和临床使用。


  制备的结果有良好的制剂学性质和抗肿瘤活性,这说明脂质体改变了药物的理化性质,表现出更优的成药性能。本研究将为LM在相关领域的应用提供数据参考。


实验室小型旋转蒸发仪